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快速建立稳定高效表达CHO细胞株技术

       抗体(Antibody，Ab)，也被称为免疫球蛋白(Ig)，是一种大型的Y型蛋白质，由免疫系统的B细胞分泌产生，用来中和病原菌和病毒等病原体，是机体的防御系统[1]。抗体由Fab和Fc组成，在生物体内，Fab和靶抗原特异结合，Fc和效应器结合，进而发挥防御作用[1]。经过科学家的不断努力，现在对抗体的认识已经比较充分，下图为人的IgG1结构。
      生物技术药物尤其是抗体药物在全球范围内取得了空前的商业成功和社会效益，正驱使更多的生物创新药物进入市场，也加剧了全球的生物创新药和仿制药研发的竞争。这种竞争驱动了对表达宿主-中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的生产能力和稳定性的更高要求。除了优化下游的大规模培养生产工艺以外，如何快速完成上游的‘稳定表达药物基因的CHO 细胞株’的筛选、提高细胞株高效表达药物基因的能力、增加细胞株的长期稳定性和在高密度培养条件下的存活率，是全球生物制药工业一直在孜孜以求的目标。

重组蛋白

       常用的重组蛋白表达宿主有细菌和真核表达系统。在真核生物的蛋白功能研究以及人类蛋白药物开发中，真核表达系统相对于细菌表达系统具有其明显的优势，诸如具有完整的蛋白折叠、组装和翻译后修饰[1,2]。真核表达系统中的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和人胚肾（HEK）细胞广泛应用于普通蛋白和治疗性重组蛋白药物研发和生产。
 
CHO细胞
       Chinese hamster ovary (CHO)细胞来源于中国仓鼠卵巢的上皮样细胞，根据不同的目的，已经发展出多种细胞系。目前对CHO细胞的研究比较深入，已经完成了对female Chinese hamster (Cricetulus griseus)、CHO-K1、DG44和 CHO-S的基因组测序[3-6]。另外，对CHO细胞的蛋白质组研究也在进行[7]。这些基础研究将极大促进其在科学研究和生物制药产业中的应用。
 

抗体糖基化改造技术

       抗体是可溶性血清糖蛋白。其功能不仅由其氨基酸序列决定，而且抗体糖基化修饰影响稳定性和可溶性，决定了其临床疗效，因此抗体糖基化成为单抗药物的一个关键质量属性（CQA）。
       治疗性抗体的糖基化形式主要为Fc N-糖基化修饰的结构，位于CH2区的共有序列（Asn297-X-Ser/Thr）。Fc糖基化修饰具有复杂性：双天线型核心结构（由甘露糖（Man）和N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）两种戊糖分子组成），还含有不同数目的糖分子，如岩藻糖（Fuc），甘露糖，N-乙酰葡糖胺，半乳糖（Gal），N-乙酰葡糖胺和唾液酸（Sia）（图1）。IgG通过糖基化修饰的重链CH2区与Fc受体和C1q补体结合形成免疫复合体，从而分别发挥抗体依赖的细胞介导的毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒性作用（CDC）。IgG的N-糖基化修饰可以促进或消除抗体的效应子功能[1-4]： 
  • 岩藻糖—无岩藻糖修饰的人IgG与FcγRIIIa亲和力提高50倍，ADCC作用提高100倍[3]。

Functional Assays 的开发

       安泰吉公司已经开发了针对重组蛋白/单克隆抗体分析检测方法，以支持药物研发。我们可从客户转移方法，并进一步优化和验证，也可以基于公司团队在分析科学和生物学的技术专长来开发新的分析方法。我们开发和验证的检测方法用于重组蛋白/单克隆抗体的分析（包括生物安全性，纯度，活性，鉴别和浓度/滴度分析）。下面列举是专为单克隆抗体分析检测的常用方法。

现有方法举例

1.蛋白质鉴定： Western Blot

2.蛋白定量：UV280/Bradford/Lowrry/BCA等

3.纯度分析：SDS-PAGE还原和非还原

4.生物活性和生物学表征：基于细胞或ELISA结合活性的检测方法

5.Fab功能表征

细胞模型构建

      安泰吉公司研发出了一套独具匠心的技术系统，称为“Toggle-In”。我们先用基因打靶技术，在CHO细胞基因组中找到一个表达的Hot-Spot，然后依次用两个载体，只用两个抗药性基因就可以实现连续、循环交替的、无上限的基因组定点插入。而且，这些CHO 细胞克隆，每个都是均质的，可以做到插入片段1:1表达（技术内容详见Toggle-In部分）。这项技术成功地解决了困扰业界多年的细胞株改造的技术瓶颈。已申请专利保护。